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前列腺为雄性附属性腺之一，而精浆主要由雄性附属性腺分泌。精浆对精子生殖力的影响有许多矛盾报道；体外获得的牛附睾尾部的精子的生殖力低于射出的精子的生殖力，但在猪猫和大鼠则相反[1]。更多的证据表明精浆蛋白与生殖力相关。高生殖力的牛精浆中存在Mr为26 k的pI6.2和Mr为55 k的pI4.5蛋白,但低生殖力的牛精浆中存在另两种蛋白[2]。马、人精浆中也发现与生殖力相关蛋白[3]。雄性附属性腺对生殖力的影响目前主要来自啮齿类动物实验，去除雄性附属性腺，特别是前列腺和精囊腺可导致小鼠、大鼠的生殖力下降, 去除全部附属性腺或壶腹腺或前列腺可引起胚胎早期死亡[4]。体外实验显示前列腺或壶腹腺可影响修饰精子的膜蛋白和膜糖蛋白[5]。交配后精浆停留于子宫内，其中的大分子不能通过子宫进入输卵管内。鉴于精子仅在射精时与附属性腺分泌物接触,[link widoczny dla zalogowanych],就此笔者认为雄性附属性腺蛋白可能与精子表面特异结合进而影响生殖力。精子表面存在附属性腺抗原和精浆来源物已有报道[6]，但缺乏对附属性腺每一腺体成员影响精子生殖力、精子膜的了解。既往研究证实腹前列腺和壶腹腺对生殖力有调节作用，进一步的研究表明仅腹前列腺起作用[4]。认识前列腺的影响生殖力的作用,首先应分离与精子作用的蛋白。本研究应用附睾精子膜蛋白亲和层析分离前列腺蛋白,应用二维电泳电泳和质谱对金黄地鼠前列腺精子膜结合蛋白进行初步分析。
1.2.1 精子膜蛋白基质亲和层析柱纯化前列腺结合蛋白附睾精子膜蛋白亲和柱的制备步骤略述如下,收集的附睾精子膜蛋白溶于磷酸盐缓冲液(pH 7.4)上DEAE-柱, 经含1 mol/L NaCl的磷酸缓冲液（PB,[link widoczny dla zalogowanych]，0.02 mol/L, pH 5.8）洗脱。收集的洗脱组分经饱和硫酸铵沉淀、过滤后用双蒸水透析后冻干即为金黄地鼠附睾精子膜蛋白（EPI）。 2 g活化CNBr-Sepharose4B凝胶经溶涨后,[link widoczny dla zalogowanych],经400 mL 10-3 mol/L HCl淋洗15 min。 30 mg的EPI溶于10 mL交联溶液内并在室温下与凝胶混匀2 h。凝胶中未结合的蛋白经600 × g 离心10 min去除。剩余的活化基团用1 mol/L甘氨酸封闭。将制备好的EPI-CNBr-Sepharose4B凝胶装柱。柱洗3遍去除非特异吸收蛋白，每1遍顺序用含1 mol/L NaCl(0.1 mol/L乙酸盐缓冲液pH 4)和含1 mol/L NaCl(0.1 mol/L硼酸盐pH 8.0)缓冲液洗, EPI-Sepharose-4B亲和柱已制备待用。前列腺分泌物在2 000 × g离心30 min，收集上清用0.05 mol/L PB, pH 7.4调整蛋白为3 mg/mL。前列腺蛋白上EPI-Sepharose4B柱, 含3 mol/L KSCN PB缓冲液洗脱特异结合蛋白。洗脱的组分收集、透析、冻干、储存于-20 ℃。
Abstract: 【Objective】 The aims of this study was to identify and purify the ventral prostate secretory sperm binding proteins and analyze the ventral prostate sperm binding proteins by 2D- electrophoresis and MOTIF. 【Methods】 The ventral prostate secretory sperm binding proteins were identified and purified by epdidymal sperm membrane affinity chromatography. The protein spots excised from 2D gels were digested with trypsin and then the resulting peptides were identified by using peptide mass fingerprinting feature by database searching. The mRNA of heat shock protein-105 and carbonyl reductase（NADPH）-3 were detected in ventral prostate gland and unfertilized oocyte by RT-PCR. 【Results】 It was purified sperm membrane proteins from ventral prostate secretory proteins. About 30 spots were separated by 2D-electrophoresis. Heat shock protein-105 and carbonyl reductase-3 are identified by MOTIF from ventral prostate sperm binding proteins. Both mRNA of heat shock protein-105 and carbonyl reductase （NADPH）-3 were expressed in ventral prostate glands and unfertilized oocyte. 【Conclusions】About 30 of ventral prostate secretory proteins bind to sperm. Heat shock protein-105 and carbonyl reductase （NADPH）-3 are identified from the ventral prostate secretory sperm binding proteins.

Key words: ventral prostate secretory protein; epdidymal sperm membrane protein; 2D-electrophoresis; mass spectometry
1.1.2 试剂及设备除非特别提及, 所有化学试剂均为分析纯并购自美国Sigma (USA) 公司。胰酶(typsin)购自美国Promega公司。等电聚焦所用的固定pH梯度胶条(immobilized pH gradient strip, IPG strip)、再水化液、覆盖液、2-D Clean-Up试剂盒均为英国Amerchan公司产品。双向电泳在Ettan IPGphor Ⅱ IEF System 和Ettan DALT twelve Large Vertical system (英国Amerchan公司)的装置上进行。飞行质谱分析采用Voyager-DETM STR (PE Biosystems, USA)质谱仪分析。
1.2 鉴定和纯化前列腺分泌物中精子结合蛋白
【关键词】前列腺分泌蛋白; 附睾精子膜蛋白; 二维凝胶电泳; 质谱
前列腺精子结合蛋白的二维凝胶电泳及质谱分析

【摘要】【目的】应用精子膜蛋白亲和层析柱分离金黄地鼠前列腺精子结合蛋白，并用二维电泳和质谱对金黄地鼠前列腺精子膜结合蛋白进行初步分析。【方法】应用附睾精子膜亲和层析柱纯化前列腺精子结合蛋白,采用二维凝胶电泳对纯化的前列腺精子膜结合蛋白进行蛋白分离和图像分析，并结合基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析及数据库搜索从而鉴定部分蛋白质斑点; RT-PCR检测已鉴定蛋白在前列腺及未受精卵子中的mRNA的表达。【结果】附睾精子膜蛋白亲和层析柱可纯化出前列腺结合蛋白，前列腺附睾精子膜蛋白结合蛋白的二维凝胶电泳蛋白图谱。分离的蛋白质斑点为30个，质谱鉴定出2个蛋白点，一为热休克蛋白105，另一羰基还原酶（NADPH）-3。前列腺和未受精卵中均表达热休克蛋白105和羰基还原酶-3的mRNA。【结论】自前列腺分泌物中分离出精子膜结合蛋白，金黄地鼠前列腺中精子结合蛋白经双向电泳及飞行质谱分析鉴定出蛋白热休克蛋白和羰基还原酶。
1 材料和方法
1.1.1 研究对象金黄地鼠前列腺分泌物及附睾精子。
1.1 材料及设备
1.1.3 附睾精子膜蛋白制备附睾精子收集, 4只健康14~20周龄雄鼠用致死量的4％戊巴比妥钠麻醉后，切开腹腔，暴露并游离附睾；用含5 mmol/L HEPES/0.264 mmol/L蔗糖缓冲液 [pH 7.4，含2 mmol/L苯甲基磺酰氟 (PMSF) 和 10 mmol/L 碘乙酰胺]的注射器21号磨平针头，经输精管逆行冲出精子。冲出精子经PBS (pH 7.4,含 2 mmol/L PMSF和10 mmol/L碘乙酰胺)洗3次 (每次在4 ℃条件下600 × g离心5 min),[link widoczny dla zalogowanych]。重悬于0.5% NP-40蔗糖缓冲液中, 调整精子浓度为2×106/mL，置于冰上20 min。然后在0 ℃，10 000 × g下离心15 min，收集上清即为膜蛋白，经超滤膜浓缩后(Centricon-3，美国Amicon公司)定量蛋白。
1.1.4 前列腺分泌物的收集将6只14周龄金黄地鼠的前列腺(VPG)分离。腺体表面切几个口，置自制不锈钢滤网上，离心收集分泌物于离心管内。收集的腺体分泌物置-20 ℃冰箱待用。
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